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Institut für bakterielle Infektionen und Zoonosen (IBIZ)

Arbeitsgruppe für durch Zecken übertragene Krankheiten

Forschungsschwerpunkt: Zecken und durch Zecken übertragene Krankheitserreger

Spezies-Bestimmung und Charakterisierung der Entwicklungsstadien von Zecken mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisation Massenspektrometrie

Neben der klassischen morphologischen Differenzierung von Zecken und deren Entwicklungsstadien gibt es schon seit längerer Zeit eine Reihe molekularbiologischer Verfahren, die z. B. auf der Analyse der 12S- oder 16S RNA mittels PCR beruhen. Nachdem sich die Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation Massenspektrometrie (MALDI-MS) in den vergangenen Jahren zur  Untersuchung  von Bakterien- und Zellkulturen als hoch informatives, schnelles und dabei kosteneffizientes Verfahren etabliert hat, erschien diese Methode potentiell geeignet, um auch so komplexe Organismen wie Zecken auf der Grundlage ihrer Proteinmuster zu differenzieren.

Es gelang, ein einfaches Protokoll zur Aufarbeitung der Zecken zu entwickeln, das die Bestimmung der Zecken mittels MALDI-MS erlaubte. Danach wurden von sieben Zeckenspezies Referenzspektren hinterlegt (I. canisuga, I. hexagonus, I. persulcatus, I. ricinus, I. scapularis, D. reticulatus und R. sanguineus).

Mittels MALDI-MS war eine Differenzierung möglich, wobei als erste Determinante für die Clusterbildung die Spezies fungierte, als zweite Determinante das jeweilige Entwicklungsstadium. Die Cluster stellten die phylogenetischen Zusammenhänge dar. Wenn genügend Untersuchungsmaterial zur Verfügung stand, konnten auch „problematische“ Proben, wie unvollständige oder gesogene Zecken noch erfolgreich zugeordnet werden. Während der Entwicklung von I. ricinus Eiern über 39 Tage änderten sich die Massenspektren dramatisch. Die Ursachen und die Bedeutung dieser Änderungen sind bisher nicht bekannt, jedoch ist es denkbar, dass mittels MALDI-MS neben der Differenzierung von Zecken auch neue Einblicke in die Entwicklungsbiologie der Zecken mit ihren limitierenden und fördernden Faktoren möglich sein könnten.

Die Erweiterung der Referenzspektren durch das Einbeziehen weiterer Zeckenspezies ist in Arbeit; künftige Untersuchungen sollen sich sowohl der Differenzierung infizierter Zecken als auch der Erfassung limitierender und fördernder Faktoren für die Entwicklung der Zecken widmen.

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FSME und Bedeutung der FSME-Virus-Diagnostik bei Tieren

Die Frühsommer-Meningoenzephalitis ist in Europa die bedeutendste durch Zecken übertragene Virusinfektion. Allein in Deutschland treten jährlich ca. 250 humane klinische Fälle auf, mit großer Schwankungsbreite von Jahr zu Jahr (u.a. 2006: 546 Fälle, 2007: 238 Fälle). Klinische Erkrankungen bei Tieren sind zwar selten, aber immer wieder und mit zum Teil dramatischen Verläufen beschrieben, z. B. bei Hunden, Pferden und Affen. Auch können FSME-Viren in der virämischen Phase über die Milch von Schafen, Ziegen und Rindern ausgeschieden werden und beim Genuss von unpasteurisierter Milch oder daraus hergestellter Produkte auf alimentärem Wege zu einer Infektion des Menschen führen. Dieser Infektionsweg, der neben der Infektion via Zeckenstich vorkommen kann, ist aber im Vergleich dazu sehr selten. Trotzdem ist Aufmerksamkeit geboten, denn in den letzten Jahren wurden Fälle alimentärer FSME-Infektion z. B. in Estland, Österreich und Ungarn beschrieben.

Darüber hinaus können Daten aus der FSME-Virus-Diagnostik bei Tieren einen wertvollen Beitrag zur epidemiologischen Untersuchung der FSME leisten. Im Gegensatz zu Borrelien, die mehr oder weniger überall da in Deutschland nachgewiesen werden können, wo Zecken vorkommen, sind FSME-Viren in größeren und kleineren Naturherden verbreitet, die große Ähnlichkeit mit einem Flickenteppich mit Schwerpunkt in Süddeutschland haben. Aus den bisherigen Untersuchungen ist bekannt, dass solche Herde sich neu herausbilden können und in manchen Regionen über Jahrzehnte stabil existieren, in anderen Gebieten aber über kurz oder lang wieder erlöschen. Die Gründe dafür sind bis heute nicht bekannt, und Untersuchungen von Tieren (sowohl der direkte Erregernachweis mittels quantitativer real-time RT-PCR (RT-qPCR) als auch serologische Untersuchungen zum Antikörpernachweis) können einen Beitrag zum besseren Verständnis der Epidemiologie der FSME als wichtigster viraler durch Zecken übertragener Krankheit in Mitteleuropa liefern.

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Nachweis von FSME-Viren

Der direkte Erregernachweis kann in Zecken (in Deutschland: Gemeiner Holzbock, Ixodes ricinus), in Gewebeproben im Rahmen pathologischer Untersuchungen, in Serum oder Liquor durchgeführt werden. Bei der sehr geringen Prävalenz der FSME-Viren in Zecken (auch in FSME-Risikogebieten in der Regel deutlich unter 10%) in Kombination mit der flickenteppichartigen Verbreitung der FSME-Viren sollte die Interpretation insbesondere von negativen Befunden in Gebieten mit FSME-Historie mit Augenmaß erfolgen und eine hinlänglich große Zahl von Zecken vor abschließender Bewertung untersucht werden.

Es gibt eine Reihe von publizierten RT-qPCR-Protokollen, die für den Nachweis von FSMEV-RNA geeignet sind. Zwei dieser Methoden wurden am FLI neu entwickelt bzw. modifiziert. Die beiden FSMEV-Assays amplifizieren unabhängige konservierte Abschnitte in der 3`- bzw. 5`-nicht translatierten Region des FSMEV-Genoms. Die Detektion der viralen RNA wird dabei mit unterschiedlichen internen Kontrollsystemen kombiniert. Einerseits wird eine Ixodes-spezifische Extraktionskontrolle (16S) zusammen mit der FSMEV-RNA co-amplifiziert. Im zweiten Assay erfolgt der FSMEV-Genomnachweis in einer Duplex-RT-qPCR zusammen mit einer heterologen Inhibitionskontrolle. Dadurch wird sowohl die erfolgreiche Extraktion der RNA aus Zecken parallel zum Erregernachweis geprüft, als auch die partielle Inhibierung des Amplifikationsprozesses ausgeschlossen.

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Nachweis von FSMEV-Antikörpern in Tierseren

Die Anzahl der für die Veterinärmedizin zur Verfügung stehenden Testkits ist gering. In unseren Arbeiten hat sich ein Vorgehen in zwei Schritten bewährt: Screening der Seren mit einem all-species-ELISA und Bestätigung der ELISA-positiven Proben im Serum-Neutralisationstest (SNT). Diese Methode bietet den Vorteil, dass ein kommerziell erhältliches ELISA-Kit verwendet werden kann und eine tierartspezifische Validierung nicht nötig ist. Gleichzeitig wird durch das Screening mittels ELISA vermieden, dass von vornherein alle Seren im sehr arbeitsaufwändigen SNT untersucht werden müssen. Da die all-species-Verwendung des ELISA auf dem Einsatz von Protein G basiert, sind allerdings unspezifisch positive Ergebnisse möglich, die zwingend mittels SNT abgeklärt werden müssen.

Der SNT wurde mit dem apathogenen kreuzneutralisierbaren Langat-Virus statt FSME-Viren durchgeführt, um eine Bearbeitung im S2-Labor zu erlauben. Diese Untersuchungen werden sicher trotzdem weitgehend in Speziallaboren durchgeführt werden.

In einer von uns durchgeführten Studie mit 3.590 Schaf- und 3.793 Ziegenseren aus den Ländern Baden-Württemberg, Bayern, Thüringen, Nordrhein-Westfalen, Niedersachsen, Schleswig-Holstein und Mecklenburg-Vorpommern hat sich die Methode bestens bewährt. Der Einsatz von Schafen und Ziegen als Sentinels hat eine Reihe neuer Erkenntnisse zur FSME-Epidemiologie ermöglicht. Diese Tierarten sind zur Untersuchung besonders gut geeignet, weil Schaf- und Ziegenseren in sehr guter Qualität bei ausgezeichneter Dokumentation praktisch bundesweit verfügbar sind, da diese Proben routinemäßig für zahlreiche andere Untersuchungen anfallen. Die Gebiete, die von den Tieren beweidet werden, sind bekannt, so dass beim Zeckenfang auf Weideflächen mit hohen Seroprävalenzen die Wahrscheinlichkeit eines Direktnachweises von FSME-Viren trotz deren flickenteppichartiger Naturherde und geringer Virusprävalenz in Zecken erheblich steigt, wie in eigenen Untersuchungen von Schaf- und Pferdeherden mit Zeckenfang in der Umgebung festgestellt werden konnte. Es ist davon auszugehen, dass sich künftig serologische Untersuchungen von Schaf- und Ziegenherden sowie anderen Weidetieren als Screening-Methode vor dem Direktnachweis in Zecken einen dauerhaften Platz in der Diagnostik und Risikoabschätzung dieser wichtigen Zoonose erobern werden. Aus den eigenen bisherigen Untersuchungen von über 18.000 Zecken und nur 7 FSMEV-positiven Nachweisen wird deutlich, dass ein ungezieltes Screening von Zeckenpopulationen zeit- und kostenintensiv bei geringen Erfolgsaussichten ist und deshalb diesem neuen methodischen Ansatz weichen sollte.

Untersuchungen zur Kreuzreaktivität der FSMEV-Antikörpertiter ergaben eine hohe Spezifität des eingesetzten ELISA-Testkits, lediglich zu Louping-ill-Antikörpern  traten Kreuzreaktionen auf. Der Test war außerdem gut geeignet, um unspezifisch positive Reaktionen im West-Nile-Virus-ELISA abzuklären.

Zum Verlauf der FSMEV-Antikörpertiter nach Antigenkontakt sind derzeit noch Beobachtungen über mehrere Jahre im Gange.

Künftige Arbeiten werden sich weiteren durch Zecken übertragenen Erregern (zunächst Borrelien und deren veterinärmedizinischer Bedeutung)

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Publikationen

Ausgewählte Publikationen der Arbeitsgruppe 

  • Klaus, C., Ziegler, U., Kalthoff, D., Hoffmann, B., Beer, M., 2014. Tick-borne encephalitis virus (TBEV) – findings on cross reactivity and longevity of TBEV antibodies in animal sera. BMC Vet. Res. 10:78.
    DOI:10.1186/1746-6148-10-78
  • Klaus, C., Hörügel, U., Hoffmann, B., Beer, M., 2013. Tick-borne encephalitis virus (TBEV) infection in horses: Clinical and laboratory findings and epidemiological investigations. Vet Microbiol 163, 368-372.
    DOI 10.1016/j.vetmic.2012.12.041
  • Karger, A., Kampen, H., Bettin, B., Dautel, H., Ziller, H., Hoffmann, B., Süss, J., Klaus, C., 2012. Species determination and characterization of developmental stages of ticks by whole animal matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry. Ticks Tickborne Dis 3, 78-89
    DOI 10.1016/j.ttbdis.2011.11.002
  • Klaus, C., Beer, M., Saier, R., Schau, U., Moog, U., Hoffmann, B., Diller, R., Süss, J., 2012. Goats and sheep as sentinels for tick-borne encephalitis (TBE) virus - epidemiological studies in areas endemic and non-endemic for TBE virus in Germany. Ticks Tickborne Dis 3, 27-37
    DOI 10.1016/j.ttbdis.2011.09.011
  • Klaus, C., Beer, M., Saier, R., Schubert, H., Bischoff, S., Süss, J., 2011. Evaluation of serological tests for detecting tick-borne encephalitis virus (TBEV) antibodies in animals. Berl. Münch. Tierärztl. Wochenschr. 124, 443-449
    DOI 10.2376/0005-9366-124-443
  • Klaus, C., Hoffmann, B., Moog, U., Schau, U., Beer, M., Süss, J., 2010. Can goats be used as sentinels for Tick-borne encephalitis (TBE) in non-endemic areas? Experimental studies and epizootological observations. Berl. Münch. Tierärztl. Wochenschr. 123, 441-445
    DOI 10.2376/0005-9366-123-10
  • Klaus, C., Hoffmann, B., Beer, M., Müller, W., Stark, B., Bader, W., Stiasny, K., Heinz, F.X., Süss, J., 2010. Seroprevalence of tick-borne encephalitis (TBE) in naturally exposed monkeys (Macaca sylvanus) and sheep and prevalence of TBE virus in ticks in a TBE endemic area in Germany. Ticks Tickborne Dis 1, 141-144
    DOI 10.1016/j.ttbdis.2010.06.001
  • Klaus, C., Hoffmann, B., Hering, U., Mielke, B., Sachse, K., Beer, M., Süss, J., 2010. Tick-borne encephalitis (TBE) virus prevalence and virus genome characterization in field-collected ticks (Ixodes ricinus) in risk, non-risk, and former risk areas of TBE, and in ticks removed from humans in Germany. Clin Microbiol Infec 16, 238–244
    DOI 10.1111/j.1469-0691.2009.02764.x

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