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Institut für molekulare Virologie und Zellbiologie (IMVZ)

Labor für Biochemie und Proteomik

Bearbeitete Erreger

  • Pseudorabies Virus
  • Herpes Simplex Virus-1
  • Bovines Herpesvirus-1
  • Influenza-A-Virus

Dienstleistungen

Das Labor für Biochemie und Proteomics stellt für das FLI eine Reihe von Analysetechniken zur Verfügung:

  • Identifizierung und von Proteinen durch ‚peptide mass fingerprint’ (Ultraflex TOF/TOF Massenspektrometer, Bruker)
  • N- und C-terminale Partialsequenzierung von Proteinen durch ISD Massenspektren
  • Zweidimensionale Gelelektrophorese, auch großformatig (Dodeca Cell, Biorad) ,Off gel’ Fokussierung (Fractionator 3200, Agilent)
  • Identifizierung von Bakterien (Biotyper 2 software, Bruker)
  • MALDI-imaging

Kurzbeschreibung der Projekte

Anwendung von Proteomics-Techniken in der Virologie

In den letzten Jahren hat der ‚Proteomics’-Ansatz Einzug in fast alle Gebiete der Biowissenschaften gehalten. Gemeint ist damit die qualitative und quantitative Analyse von größeren Zahlen (hunderte bis tausende) von Proteinen zur Charakterisierung eines bestimmten Zustandes der Zelle, z. B. nach einer Virusinfektion. Als analytische Plattform stehen im Labor für Biochemie und Proteomics eine großformatige zweidimensionale Gelelektrophorese, ein Roboter zum automatischen in-Gel Proteinverdau, eine LC-MALDI Kopplung sowie ein Ultraflextreme TOF/TOF. Zur Analyse eukaryontischer Zellen sind quantitative Veränderungen im Proteom von besonderer Bedeutung, die sich in Zellkultur hervorragend durch das ‚stable isotope labelling with amino acids in cell culture’ (SILAC) Verfahren erfassen lassen (Ong et al., 2002). In SILAC-Studien mit Pseudorabies Virus infizierten Zellen (Skiba, Mettenleiter & Karger, 2008) konnten eine Reihe von bisher nicht beschriebenen zellulären Reaktionen auf die Infektion beschrieben werden. Die SILAC Technik erlaubt nicht nur den Vergleich von infizierten und scheininfizierten Zellen, sondern auch die quantitative Analyse von Proteomveränderungen nach Infektion mit verschiedenen Viren (Skiba et al., 2010), so dass auch die Reaktion der Zelle auf einzelne Virusproteine im Kontext einer Infektion erfasst werden kann.

Literatur:

  • Ramp K, Skiba M, Karger A, Mettenleiter TC, Römer-Oberdörfer A. 2011. Influence of insertion site of the avian influenza virus haemagglutinin (HA) gene within the Newcastle disease virus genome on HA expression.
    J Gen Virol 92:355-360.
  • Skiba M, Glowinski F, Koczan D, Mettenleiter TC, Karger A. (2010). Gene expression profiling of Pseudorabies virus (PrV) infected bovine cells by combination of transcript analysis and quantitative proteomic techniques.
    Vet Microbiol 143:14-20.
  • Skiba M, Mettenleiter TC, Karger A. (2008). Quantitative whole-cell proteome analysis of pseudorabies virus-infected cells.
    J Virol 82:9689-99.

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Zusammensetzung mutierter Pseudorabies-Virionen

Das Genom des Alphaherpesvirus Pseudorabies Virus (PrV) kodiert für über 70 Proteine, von denen viele auch Strukturbestandteile des Viruspartikels sind. Neben den viruskodierten Proteinen enthält das Viruspartikel aber auch Bestandteile der Zelle, wie z.B. die Lipidhülle, aber auch zelluläre Proteine, deren Bedeutung für die Virusmorphogenese bisher ungeklärt sind. Nach 2D-elektrophoretischer Analyse hochgereinigter Viruspartikel und massenspektrometrischer Identifizierung der Einzelkomponenten wurde eine 2D Karte des PrV erstellt. Durch Anwendung einer massenspektrometrischen Quantifizierungstechnik, die auf stabilen Isotopen beruht (‚stable isotope labelling with amino acids in cell culture’, SILAC), konnte auch die quantitative Zusammensetzung von mutierten Pseudorabies Vironen sehr genau bestimmt werden (Michael et al., 2006; Michael et al., 2006; Bottcher et al., 2006; Michael et al., 2007; Fuchs et al., 2007). Auf diese Weise konnten neue Erkenntnisse zu Interaktionen verschiedener Virusstrukturproteine während der Virusmorphogenese gewonnen werden. In laufenden Projekten wird an der Analyse der Zusammensetzung verschiedener Morphogenesestadien von Herpesvirionen mit Hilfe des SILAC Verfahrens gearbeitet.

Literatur:

  • Fuchs W, Granzow H, Klupp BG, Karger A, Michael K, Maresch C, Klopfleisch R, Mettenleiter TC. (2007). Relevance of the interaction between alphaherpesvirus UL3.5 and UL48 proteins for virion maturation and neuroinvasion.
    J Virol 81:9307-18.
  • Michael K, Klupp BG, Karger A, Mettenleiter TC. (2007). Efficient incorporation of tegument proteins pUL46, pUL49, and pUS3 into pseudorabies virus particles depends on the presence of pUL21.
    J Virol 81:1048-51.
  • Michael K, Böttcher S, Klupp BG, Karger A, Mettenleiter TC. (2006). Pseudorabies virus particles lacking tegument proteins pUL11 or pUL16 incorporate less full-length pUL36 than wild-type virus, but specifically accumulate a pUL36 N-terminal fragment.
    J Gen Virol 87:3503-7.
  • Böttcher S, Klupp BG, Granzow H, Fuchs W, Michael K, Mettenleiter TC. (2006). Identification of a 709-amino-acid internal nonessential region within the essential conserved tegument protein (p)UL36 of pseudorabies virus.
    J Virol 80:9910-5.
  • Michael K, Klupp BG, Mettenleiter TC, Karger A. (2006). Composition of pseudorabies virus particles lacking tegument protein US3, UL47, or UL49 or envelope glycoprotein E.
    J Virol 80:1332-9.

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Massenspektrometrische Diagnose von Influenza A Virus-Infektionen

Der Ausbruch der Vogelgrippe im Jahr 2005 hat die Bedeutung einer schnellen, sicheren und hochdurchsatzfähigen Diagnose von Infektionen mit dem Influenza A Virus (AIV) erneut unterstrichen. Im Rahmen des Forschungs-Sonderprogrammes Influenza (FSI) wurde eine auf MALDI-Massenspektrometrie basierende Diagnose von AIV entwickelt (Michael et al., 2009). Das Verfahren des ‚restriction fragment mass fingerprint’ (RFMF) beruht auf der Massenanalyse von Nukleinsäurefragmenten, die durch den Restriktionsverdau eines Amplifikates des Hämagglutin Genes des AIV gewonnen werden. Das Differenzierungsvermögen des Verfahrens ist hoch genug, um verschiedene AIV-Stämme des gleichen Subtyps H5N1 zu unterscheiden. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Biomathematik des FLI werden die theoretischen Grundlagen der Klassifizierung von PCR-Produkten durch MALDI-TOF MS untersucht (Ziller et al. 2011).

Literatur:

  • Ziller M, Gussmann M, Karger A. 2011. Mathematical Aspects of Classifying Mass Spectra. Diagnostic Discrimination of Influenza-subtypes. In: Dress A et al. (eds.), The Math of Flu, Heft 17, Reihe: Biometrie und Medizinische Information – Greifswalder Seminarberichte, Shaker Verlag, Aachen, ISBN: 978-3-8322-9763-3, pp. 101-123.
  • Michael K, Harder TC, Mettenleiter TC, Karger A. (2009). Diagnosis and strain differentiation of avian influenza viruses by restriction fragment mass analysis.
    J Virol Methods 158:63-9.

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MALDI-Typisierung von Bakterien und Gewebekulturen

Die Identifizierung und taxonomische Klassifizierung von Bakterien durch Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation Flugzeit Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) hat als ‚intact cell mass spectrometry‘ (ICMS) in den letzten Jahren Einzug in viele bakteriologische Laboratorien gehalten. Die Gründe dafür liegen vor allem in der Schnelligkeit, der hohen Kosteneffizienz und in der Hochdurchsatzfähigkeit des Verfahrens. Ausgehend von einer Bakterienkolonie kann in der Regel ein Ergebnis innerhalb von 45 Minuten erwartet werden, in günstigen Fällen innerhalb von wenigen Minuten. Die Kosten und der Arbeitsaufwand pro Analyse sind sehr gering, die Aussagefähigkeit der Spektren kann in einzelnen Fällen die der klassischen bakteriologischen Untersuchung übertreffen oder entscheidend ergänzen.

Für bakteriologische Routineuntersuchungen steht eine kommerzielle Datenbank mit über 3200 Referenzspektren ebenso zur Verfügung wie eine veterinärhygienisch orientierte Referenzdatenbank mit über 300 eigenen Referenzspektren. Referenzspektren können nicht nur zur Identifizierung unbekannter Proben, sondern auch für phylogenetische oder epidemiologische Untersuchungen herangezogen werden.

Neben der MALDI-TOF Charakterisierung von Bakterien wurde in Zusammenarbeit mit der Zellbank des FLI auch ein Protokoll zur Charakterisierung von Gewebekulturen (Karger et al., 2010) etabliert, bei denen ICMS bisher noch nicht beschrieben wurde. Die Technologie lässt sich auch zur Charakterisierung von Zecken anwenden, wie wir in Zusammenarbeit mit dem NRL für durch Zecken übertragene Krankheiten zeigen konnten (Karger et al., 2012a).

Literatur:

  • Karger A, Kampen H, Bettin B, Dautel H, Ziller M, Hoffmann B, Süss J, Klaus C. 2012a. Species determination and characterization of developmental stages of ticks by whole-animal matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.
    Ticks Tick-Borne Dis 3:78-89.
  • Karger A, Stock R, Ziller M, Elschner MC, Bettin B, Melzer F, Maier T, Kostrzewa M, Scholz HC, Neubauer H, Tomaso H. 2012b. Rapid identification of Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei by intact cell Matrix-assisted Laser Desorption/Ionisation mass spectrometric typing.
    BMC Microbiol 12:229.
  • Löhr CV, Polster U, Kuhnert P, Karger A, Rurangirwa FR, Teifke JP. 2012. Mesenteric Lymphangitis and Sepsis Due to RTX Toxin-Producing Actinobacillus spp in 2 Foals With Hypothyroidism-Dysmaturity Syndrome.
    Vet Pathol 49:592-601.
  • Karger, A., M. Ziller, B. Bettin, B. Mintel, S. Schares, and L. Geue. (2011). Determination of Serotypes of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Isolates by Intact Cell Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight Mass Spectrometry.
    Appl Environ Microbiol 77:896-905.
  • Karger A, Bettin B, Lenk M, Mettenleiter TC. (2010). Rapid characterisation of cell cultures by matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometric typing.
    J Virol Methods 164:116-21.