Navigation überspringen

Institut für molekulare Virologie und Zellbiologie (IMVZ)

Labor für Herpesvirus-Wirtszell-Interaktionen

Bearbeitete Erreger

  • Pseudorabies Virus (PrV)
  • Herpes Simplex Virus (HSV)

Molekularbiologie des Pseudorabiesvirus (PrV)-Erreger der Aujeszkyschen Krankheit

Das Pseudorabiesvirus (PrV; auch Suid Alphaherpesvirus 1, SuHV-1, oder Aujeszky‘s Disease Virus, ADV) ist der Erreger der Aujeszkyschen Krankheit (AK) beim Schwein. PrV kann jedoch aufgrund seines breiten Wirtsspektrums eine Vielzahl von Säugetieren infizieren, wobei die Infektion nahezu unweigerlich zum Tod führt. Nur Schweine können abhängig vom Alter des Tieres und von der Virulenz des Virus eine Infektion überleben und gelten daher als der natürliche Wirt. Höhere Primaten einschließlich des Menschen sowie Einhufer sind resistent gegenüber einer Infektion (Mettenleiter, 2008). 
Das PrV wird in die Unterfamilie Alphaherpesvirinae gruppiert zu der auch die humanpathogenen Herpes Simplex Viren 1 und 2, Verursacher des Herpes labialis (Lippenbläschen) und genitalis, und das Varizella-Zoster-Virus, der Erreger der Windpocken und der Gürtelrose gehören, wie auch andere wichtige tierpathogene Vertreter, z.B. das Virus der infektiösen bovinen Rhinotracheitis bzw. der infektiösen pustulösen Vulvovaginitis beim Rind (Bovines Alphaherpesvirus 1, BoHV-1), sowie die Erreger der infektiösen Laryngotracheitis (ILTV) oder der Marekschen Erkrankung beim Huhn (MDV) (Roizman & Pellet, 2001). 
Die schnelle lytische Ausbreitung, das breite Wirtsspektrum, die fehlende Humanpathogenität, und die Verfügbarkeit des natürlichen Wirts als Versuchstier machen PrV zu einem idealen Objekt für Untersuchungen über die molekularen Mechanismen der Herpesvirusinfektion in vitro und in vivo. 

Abb.1: Aufbau eines Herpesviruspartikels (PrV).

Die Viruspartikel (=Virionen) aller Herpesviren sind morphologisch identisch aus vier Untereinheiten aufgebaut (Abbildung 1). Der innere Kern enthält das doppelsträngige DNA- Genom (core), das bei PrV aus mehr 143 Kilobasenpaaren besteht. Das Genom ist in ein ikosaedrisches Kapsid eingelagert und bildet mit diesem zusammen das Nukleokapsid. Das Nukleokapsid wiederum ist vom sogenannten Tegument, äquivalent zur Matrix der RNA-Viren, umgeben. Die äußere Hülle bildet eine von der Wirtszelle stammende Lipidmembran in die virusspezifische, meist mit Zuckerketten modifizierte Proteine (= Glykoproteine) eingelagert sind. 

Abb.2: Replikationszyklus der Herpesviren.

Das Pseudorabiesvirus gehört zu den funktionell und strukturell am besten untersuchten Herpesviren. Der Infektionszyklus ist schematisch in Abbildung 2 dargestellt. Wir interessieren uns vor allem für die Stadien des Viruseintritts (1-2), der Freisetzung reifer Nukleokapside aus dem Kern (9-11), sowie der Tegumentanlagerung und sekundären Umhüllung im Zytoplasma (11-13). Ein weiteres Ziel ist die funktionelle Charakterisierung der ca. 70 Genprodukte des PrV. Als neurotropes Herpesvirus besitzt PrV außerdem die Fähigkeit, sich in Neuronen zu vermehren und auszubreiten. Auch hier sind die molekularen Grundlagen Gegenstand intensiver Forschung. Neben den Analysen in der Zellkultur wird die Funktion spezifischer Virusproteine auch im Tier, vorwiegend in Maus und Schwein, überprüft.
 

Literatur

  • Mettenleiter T C. 2008. Pseudorabies Virus. Encyclopedia of Virology, 5 vols. (B.W.J. Mahy and M.H.V. Van Regenmortel, Editors), pp. 341-351 Oxford: Elsevier.

Nach oben

Kurzbeschreibung laufender Projekte

Funktion viraler Proteine bei der Virusinfektion

Die Infektion der Wirtszelle beginnt mit dem Anheften des Virions an die Wirtszelle, wobei der erste Kontakt über das virale Glykoprotein (g)C mit Zuckerketten-haltigen Oberflächenproteinen der Wirtszelle erfolgt. Diese zunächst lose Verbindung wird durch eine zweite Interaktion von viralem gD mit spezifischen zellulären Rezeptoren verstärkt. Durch ein noch nicht vollständig verstandenes Zusammenspiel der Glykoproteine gD, gB, und dem gH/gL Komplex erfolgt die Fusion der Virushülle mit der Plasmamembran, wodurch die Nukleokapside und das Tegument ins Zellinnere gelangen. Die Fusion von Membranen kann in vitro durch Expression der Glykoproteine simuliert werden (Abbildung 3). Hierfür werden bei PrV im Gegensatz zu HSV nur die Glykoproteine gB, gH und gL, aber nicht gD benötigt. gB stellt zwar das eigentliche Fusionsprotein dar, es ist aber für die Membranfusion auf die Anwesenheit des gH/gL Komplexes angewiesen, dessen Funktion noch unklar ist. Während gH dabei unverzichtbar ist, kann die Funktion von gL, bzw. der gL-bindenden Domäne in gH durch Veränderungen in den anderen an der Fusion beteiligten Glykoproteinen kompensiert werden. Mit Hilfe der ermittelten Kristallstrukturen für die Glykoproteine gB und gH werden nun die molekularen Mechanismen der Membranfusion durch strukturbasierte, gezielte Mutagenesen weiter entschlüsselt.

Abb. 3: In vitro Transfektions-Fusions-Assay.

Literatur

  • Backovic M, DuBois RM, Cockburn JJ, Sharff AJ, Vaney MC, Granzow H, Klupp BG, Bricogne G, Mettenleiter TC, Rey FA. 2010. Structure of a core fragment of glycoprotein H from pseudorabies virus in complex with antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 107:22635-40.
  • Schröter C, Vallbracht M, Altenschmidt J, Kargoll S, Fuchs W, Klupp BG, Mettenleiter TC. 2015. Mutations in Pseudorabies Virus Glycoproteins gB, gD, and gH Functionally Compensate for the Absence of gL. J. Virol. 90:2264-2272
  • Vallbracht M, Schröter, C., Klupp, B. G. and Mettenleiter, T. C. 2017. Transient Transfection-based Fusion Assay for Viral Proteins. Bio-protocol 7.
  • Vallbracht M, Rehwaldt S, Klupp BG, Mettenleiter TC, Fuchs W. 2017. Functional Relevance of the N-Terminal Domain of Pseudorabies Virus Envelope Glycoprotein H and Its Interaction with Glycoprotein L. J Virol. 91:. pii: e00061-17. doi: 10.1128/JVI.00061-17.
  • Vallbracht M, Brun D, Tassinari M, Vaney MC, Pehau-Arnaudet G, Guardado-Calvo P, Haouz A, Klupp BG, Mettenleiter TC, Rey FA, Backovic M. 2017. Structure-function dissection of the Pseudorabies virus glycoprotein B fusion loops. J Virol. pii: JVI.01203-17.
  • Vallbracht M, Fuchs W, Klupp BG, Mettenleiter TC. 2018. Functional Relevance of the Transmembrane Domain and Cytoplasmic Tail of the Pseudorabies Virus Glycoprotein H for Membrane Fusion. J Virol. 92. pii: e00376-18.

Nach oben

Primäre Umhüllung und Freisetzung der Nukleokapside aus dem Kernspalt

Die Kapside der Herpesviren werden im Kern infizierter Zellen in einem autokatalytischen Prozess zusammengebaut. Hier erfolgt auch die Verpackung des viralen Genoms. Anschließend werden die reifen Kapside aus dem Kern transportiert. Dies erfolgt durch ein Anheften und Knospen an der inneren Kernmembran und führt nach dem Abschnüren des Membranvesikels zu einem (primär) umhüllten Kapsid im Kernspalt. Diese primäre Hülle geht durch Fusion mit der äußeren Kernmembran wieder verloren und das Nukleokapsid wird ins Zytoplasma freigesetzt. Während über die beteiligten zellulären Proteine wenig bekannt ist, sind die viralen Proteine pUL34 und pUL31, die bei diesem Prozess eine entscheidende Rolle spielen, gut charakterisiert. pUL34 ist ein Membranprotein, das in die Kernmembranen eingelagert wird und zusammen mit seinem Interaktionspartner pUL31 den sogenannten nuclear egress complex (NEC) an der inneren Kernmembran bildet. Die Expression dieser beiden viralen Proteine alleine reicht aus, um Membranvesikel von der inneren Kernmembran und von synthetischen Membranen (GUV = giant unilamellar vesicles) abzuschnüren, die primären Virushüllen ähneln (Klupp et al., 2007; Lorenz et al., 2015). Hierbei sind offensichtlich keine weiteren viralen oder zellulären Proteine beteiligt. Durch eine Kombination von Cryo-Elektronenmikroskopie und -Tomographie (Hagen et al., 2015), sowie kristallographischen Analysen des NEC (Zeev-Ben-Mordehai et al., 2015) konnten wir zeigen, dass durch die Oligomerisierung des dimeren NEC in eine Honigwaben-förmige Struktur die innere Kernmembran so deformiert wird, dass es schließlich zur Abschnürung eines Membranvesikels kommt. 

Geklärt werden soll nun der molekulare Mechanismus der Fusion der primären Vesikel-Hülle mit der äußeren Kernmembran. Wir konnten bereits zeigen, dass die viralen Glykoproteine, die an der Fusion während des Eintritts in Wirtszellen eine Rolle spielen, an diesem Prozess nicht beteiligt sind (Klupp et al., 2008). Vermutlich wird ein zellulärer Fusionsapparat von den Herpesviren für die Freisetzung aus dem Kern genutzt. Die Beteiligung zellulärer Kernmembran-Proteine an der Freisetzung der Nukleokapside aus dem Kernspalt wird derzeit untersucht (Hellberg et al., 2015). 

Abb. 4: Schematische Darstellung der Freisetzung der Nukleokapside aus dem Kern.

Abb. 5: Schematische Darstellung der Kernmembran.
 

Literatur

  • Klupp B.G., H. Granzow, W. Fuchs, G.M. Keil, S. Finke, and T.C. Mettenleiter. 2007. Vesicle formation from the nuclear membrane is induced by coexpression of two conserved herpesvirus proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104: 7241-7246.
    www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17426144
  • Klupp, B.G., J. Altenschmidt, H. Granzow, W. Fuchs, and T.C. Mettenleiter. 2008. Glycoproteins required for entry are not necessary for egress of pseudorabies virus. J. Virol. 82:6299-309. 
    www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18417564
  • Mettenleiter TC, Müller F, Granzow H, Klupp BG. 2013. The way out: what we know and do not know about herpesvirus nuclear egress. Cell Microbiol. 15:170-178.
  • Lorenz M, Vollmer B, Unsay JD, Klupp BG, García-Sáez AJ, Mettenleiter TC, Antonin W. 2015. A single herpesvirus protein can mediate vesicle formation in the nuclear envelope. J Biol Chem. 290:6962-6974.
  • Zeev-Ben-Mordehai T, Weberruß M, Lorenz M, Cheleski J, Hellberg T, Whittle C, El Omari K, Vasishtan D, Dent KC, Harlos K, Franzke K, Hagen C, Klupp BG, Antonin W, Mettenleiter TC, Grünewald K. 2015. Crystal Structure of the Herpesvirus Nuclear Egress Complex Provides Insights into Inner Nuclear Membrane Remodeling. Cell Rep. 13:2645-2652.
  • Hagen C, Dent KC, Zeev-Ben-Mordehai T, Grange M, Bosse JB, Whittle C, Klupp BG, Siebert CA, Vasishtan D, Bäuerlein FJ, Cheleski J, Werner S, Guttmann P, Rehbein S, Henzler K, Demmerle J, Adler B, Koszinowski U, Schermelleh L, Schneider G, Enquist LW, Plitzko JM, Mettenleiter TC, Grünewald K. 2015. Structural Basis of Vesicle Formation at the Inner Nuclear Membrane. Cell 163:1692-1701.
  • Hellberg T, Paßvogel L, Schulz KS, Klupp BG, Mettenleiter TC. 2016. Nuclear Egress of Herpesviruses: The Prototypic Vesicular Nucleocytoplasmic Transport. ADV Virus Res.94:81-140.

 

Nach oben

Funktion und Wechselwirkung viraler und zellulärer Proteine beim Viruszusammenbau

Herpesviruspartikel bestehen aus mindestens 30 verschiedenen Proteinen, die beim Viruszusammenbau in die vier strukturellen Untereinheiten eingebaut werden müssen (Abbildung 1). Während der Zusammenbau des Kapsids und die Verpackung des Genoms im Kern der infizierten Zelle stattfinden, werden der größte Teil des Teguments und die Virushülle im Zytoplasma zusammengefügt. Dieser als secondary envelopment bezeichnete Prozess folgt einem komplizierten Muster von Proteinwechselwirkungen. Die Aufklärung der Interaktionen und Rolle der Tegumentproteine beim Zusammenbau sind Gegenstand von Untersuchungen in unserem Labor. 

Abb. 6: Virale und zelluläre Interaktionspartner.

Literatur

Nach oben

Funktionelle Charakterisierung aller Genprodukte des PrV

Das PrV Genom kodiert für mindestens 70 verschiedene Proteine. Während die Funktion einiger dieser Genprodukte schon gut verstanden ist, gibt es für eine Reihe von Virusproteinen noch keine funktionelle Zuordnung. Ein Gesamtbild der Funktionen der verschiedenen Proteine bei der Virusvermehrung ist Ziel unserer Arbeiten. 

Abb. 7: Anordnung der offenen Leseraster und Transkripte im Genom des PrV.

Literatur

Nach oben

Grundlagen des Neurotropismus

Als neurotropes Alphaherpesvirus besitzt PrV die Eigenschaft, sich nach Infektion peripherer Epithelien und Nervenendigungen intra- und transneuronal auszubreiten. Die molekularen Grundlagen für diese neuronengebundene Ausbreitung sind noch weitgehend unverstanden. Durch Markierung des kleinen Kapsidproteins pUL35 mit autofluoreszierenden Proteinen können Kapside in Echtzeit mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie lokalisiert und verfolgt werden. In Kombination mit Elektronenmikroskopie und gezielter Mutagenese untersuchen wir die molekularen Grundlagen der neuronalen Ausbreitung an Neuronenkulturen. 

Abb. 8: Vergleich autofluoreszierender, GFP-markierter Kapside und elektronenmikroskopischer Aufnahme eines PrV-infizierten Rattenneurons.

Die Eigenschaft der neuronalen Ausbreitung von PrV wird außerdem zur Kartierung neuronaler Netzwerke verwendet. Wir haben ein attenuiertes, als Lebendvakzine eingesetztes PrV (Stamm Bartha) genetisch so verändert, dass infizierte Zellen durch einfache Detektionsreaktionen nachgewiesen werden können. Unterschiedlich markierte Virusmutanten erlauben die gleichzeitige Verfolgung mehrerer Nervenschaltkreise. Die Technik des 'viralen Tracing' erfreut sich in der Neuroanatomie und -biologie steigender Beliebtheit, wobei gegenüber anderen verwendeten Tracern, wie z. B. dem Herpes simplex Virus oder dem Tollwutvirus, PrV den entscheidenden Vorteil der fehlenden Humanpathogenität aufweist. 
 

Literatur

  • Rothermel M., N. Schöbel, N. Damann, B.G. Klupp, T.C. Mettenleiter, H. Hatt, and C.H. Wetzel. 2007. Anterograde transsynaptic tracing in the murine somatosensory system using Pseudorabies virus (PrV): a "live-cell"-tracing tool for analysis of identified neurons in vitro. J. Neurovirol. 13: 579-585.
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18097889
  • Rothermel, M., D. Brunert, B.G. Klupp, M. Luebbert, T.C. Mettenleiter, and H. Hatt. 2009. Advanced tracing tools: functional neuronal expression of virally encoded fluorescent calcium indicator proteins. J. Neurovirol. 15:458-464.
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20105103
  • Maresch, C., H. Granzow, A. Negatsch, B.G. Klupp, W. Fuchs, J.P. Teifke and T.C. Mettenleiter. 2010. Ultrastructural analysis of virion formation and anterograde intraaxonal transport of the alphaherpesvirus pseudorabies virus in primary neurons. J. Virol., in press.
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20237081
  • Negatsch A, Granzow H, Maresch C, Klupp BG, Fuchs W, Teifke JP, Mettenleiter TC. 2010. Ultrastructural analysis of virion formation and intraaxonal transport of herpes simplex virus type 1 in primary rat neurons. J Virol. 84:13031-13035.

Nach oben

Untersuchungen zur Pathogenese in der Maus

Die Charakterisierung verschiedener Deletionsmutanten zeigte, dass einige Proteine für die Virusvermehrung in der Zellkultur keine oder nur eine geringe Rolle spielen, aber für die Ausbreitung im Wirt bzw. für die Pathogenese wichtig sind. Diese Mutanten werden zunächst im Mausmodell näher untersucht, um die komplexen Wechselwirkungen zwischen Virus und Wirt besser zu verstehen.

Literatur

  • Klopfleisch R, Klupp BG, Fuchs W, Kopp M, Teifke JP, Mettenleiter TC. 2006. Influence of pseudorabies virus proteins on neuroinvasion and neurovirulence in mice. J Virol. 80:5571-5576.

Weiterführende Literatur

  • Mettenleiter TC, Ehlers B, Müller T, Yoon KJ, Teifke JP. 2012. Herpesviruses. In: Diseases of Swine (10th Edition), Edited by Zimmerman JJ, Karriker LA; Ramirez, A., Schwarz KJ, Stevenson GW. John Wiley & Sons.