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Institut für molekulare Virologie und Zellbiologie (IMVZ)

Labor für Herpesvirus-Wirtszell-Interaktionen

Bearbeitete Erreger

  • Pseudorabies Virus (PrV)
  • Herpes Simplex Virus (HSV)

Molekularbiologie des Pseudorabiesvirus (PrV)-Erreger der Aujeszkyschen Krankheit

Das Pseudorabiesvirus (PrV; auch Suid Herpesvirus 1, SuHV-1, oder Aujeszkys Disease Virus, ADV) ist der Erreger der Aujeszkyschen Krankheit (AK) beim Schwein. PrV kann jedoch aufgrund seines breiten Wirtsspektrums eine Vielzahl von Säugetieren infizieren, wobei die Infektion nahezu unweigerlich zum Tod führt. Nur Schweine können abhängig vom Alter des Tieres und von der Virulenz des Virus eine Infektion überleben und gelten daher als der natürliche Wirt. Höhere Primaten einschließlich des Menschen sowie Einhufer sind resistent gegenüber einer Infektion (Mettenleiter, 2008).

Das PrV wird in die Unterfamilie Alphaherpesvirinae gruppiert zu der auch die humanpathogenen Herpes Simplex Viren Typ 1 und 2, Verursacher des Herpes labialis (Lippenbläschen) und genitalis, und das Varizella-Zoster-Virus, der Erreger der Windpocken und der Gürtelrose gehören, wie auch andere wichtige tierpathogene Vertreter, z. B. das Virus der infektiösen bovinen Rhinotracheitis bzw. der infektiösen pustulösen Vulvovaginitis beim Rind (Bovines Herpesvirus 1, BoHV-1), sowie die Erreger der infektiösen Laryngotracheitis (ILTV) oder der Marekschen Erkrankung beim Huhn (MDV) (Roizman & Pellet, 2001).

Die schnelle lytische Ausbreitung, das breite Wirtsspektrum, die fehlende Humanpathogenität, und die Verfügbarkeit des natürlichen Wirts als Versuchstier machen PrV zu einem idealen Objekt für Untersuchungen über die molekularen Mechanismen der Herpesvirusinfektion in vitro und in vivo.

Abb.1: Aufbau eines Herpesviruspartikels (PrV).

Die Viruspartikel (=Virionen) aller Herpesviren sind morphologisch identisch aus vier Untereinheiten aufgebaut (Abbildung 1). Der innere Kern enthält das doppelsträngige DNS- Genom (core), das bei PrV aus mehr 143 Kilobasenpaaren besteht. Das Genom ist in ein ikosaedrisches Kapsid eingelagert und bildet mit diesem zusammen das Nukleokapsid. Das Nukleokapsid wiederum ist vom sogenannten Tegument, äquivalent zur Matrix der RNA-Viren, umgeben. Die äußere Hülle bildet eine von der Wirtszelle stammende Lipidmembran in die virusspezifische, meist mit Zuckerketten modifizierte Proteine (= Glykoproteine) eingelagert sind.

Abb.2: Replikationszyklus der Herpesviren.

Das Pseudorabiesvirus gehört inzwischen zu den funktionell und strukturell am besten untersuchten Herpesviren. Der Infektionszyklus der Herpesviren ist schematisch in Abbildung 2 dargestellt. Wir interessieren uns vor allem für die Stadien des Viruseintritts (1-2), des anschließenden Transportes des Nukleokapsids zum Kern und des Andockens an die Kernpore (3-5), der Freisetzung reifer Nukleokapside aus dem Kern (9-11), sowie der Tegumentanlagerung und sekundären Umhüllung im Zytoplasma (11-13). Ein weiteres Ziel ist die funktionelle Charakterisierung der ca. 70 Genprodukte des PrV. Die Gene annotations geben einen Überblick über die bisher bekannten Erkenntnisse zu den Genprodukten. Als neurotropes Herpesvirus besitzt PrV außerdem auch die Fähigkeit, sich in Neuronen zu vermehren und auszubreiten. Auch hier sind die molekularen Grundlagen Gegenstand intensiver Forschung.

Literatur

  • Mettenleiter T C. 2008. Pseudorabies Virus. Encyclopedia of Virology, 5 vols. (B.W.J. Mahy and M.H.V. Van Regenmortel, Editors), pp. 341-351 Oxford: Elsevier.

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Kurzbeschreibung laufender Projekte

Funktion viraler Proteine bei der Virusinfektion

Die Infektion der Wirtszelle beginnt mit dem Anheften des Virions an die Wirtszelle, wobei der erste Kontakt über das virale Glykoprotein (g)C mit Zuckerketten-haltigen Oberflächenproteinen der Wirtszelle erfolgt. Diese zunächst lose Verbindung wird durch eine zweite Interaktion von viralem gD mit spezifischen zellulären Rezeptoren verstärkt. Durch ein noch nicht vollständig verstandenes Zusammenspiel der Glykoproteine gD, gB, gH und gL erfolgt die Fusion der Virushülle mit der Plasmamembran, wodurch die Nukleokapside und das Tegument ins Zellinnere gelangen. Die Fusion von Membranen kann in vitro durch Expression der Glykoproteine simuliert werden. Hierfür werden bei PrV im Gegensatz zu HSV nur die Glykoproteine gB, gH und gL, aber nicht gD benötigt. Durch Mutagenese der Fusionspartner gB, gH und gL soll die Funktion der einzelnen Komplexpartner näher charakterisiert werden.

Abb. 3: In vitro Transfektions-Fusions-Assay.

Literatur

  • Turner, A, B. Bruun, T. Minson, and H. Browne. 1998. Glycoproteins gB, gD, and gHgL of herpes simplex virus type 1 are necessary and sufficient to mediate membrane fusion in a Cos cell transfection system. J. Virol. 72:873-875.

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Transport zur und Andocken des Nukleokapsids an die Kernpore

Nach der Fusion der Virushülle und der Plasmamembran gelangen das Tegument und das Nukleokapsid ins Zytoplasma. Das Nukleokapsid wird an Mikrotubuli entlang zum Zellkern transportiert. Unklar ist noch, welche viralen Proteine für diesen Transport notwendig sind bzw. welche mit den zellulären Motorproteinen interagieren. Durch Immunelektronenmikroskopie konnten wir zeigen, dass zumindest die Tegumentproteine pUL36, pUL37 sowie die Kinase pUS3 bis zum Andocken an die Kernpore am Kapsid verbleiben und somit neben den Kapsidproteinen als mögliche Interaktoren mit zellulären Motorkomplexen in Frage kommen. Mit Hilfe von Virusmutanten, die ein grün fluoreszierendes Kapsidprotein exprimieren, untersuchen wir die Transportprozesse mit Hilfe des Confokalen Lasermikroskops in Echtzeit. Durch in vitro Interaktionsstudien, wie z. B. Hefe-2-Hybridanalysen, sollen die viralen und zellulären Interaktionspartner identifiziert und charakterisiert werden.

Abb. 4: Transport der Nukleokapside zum Kern.

Literatur

  • Krautwald, M., C. Maresch, B.G. Klupp, W. Fuchs, and T.C. Mettenleiter. 2008. Deletion or green fluorescent protein tagging of the pUL35 capsid component of pseudorabies virus impairs virus replication in cell culture and neuroinvasion in mice. J. Gen. Virol. 89, 89:1346-1351.
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18474549
  • Krautwald, M., W. Fuchs, B.G. Klupp, and T.C. Mettenleiter. 2009. Translocation of incoming pseudorabies virus capsids to the cell nucleus is delayed in the absence of tegument protein pUL37. J. Virol. 83:3389-3396.
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19144717

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Primäre Umhüllung und Freisetzung der Nukleokapside aus dem Kernspalt

Die Kapside der Herpesviren werden im Kern infizierter Zellen in einem autokatalytischen Prozess zusammengebaut. Hier erfolgt auch die Verpackung des viralen Genoms. Anschließend werden die reifen Kapside aus dem Kern transportiert. Dies erfolgt durch ein Anheften und Knospen an der inneren Kernmembran und führt nach dem Abschnüren des Membranvesikels zu einem (primär) umhüllten Kapsid im Kernspalt. Diese primäre Hülle geht allerdings durch Fusion mit der äußeren Kernmembran wieder verloren und das Nukleokapsid wird ins Zytoplasma freigesetzt. Während über die beteiligten zellulären Proteine erst wenig bekannt ist, sind die viralen Proteine pUL34 und pUL31, die bei diesem Prozess eine entscheidende Rolle spielen, bereits gut charakterisiert. pUL34 ist ein Membranprotein, das in die Kernmembranen eingelagert wird. pUL31 findet sich in Abwesenheit anderer Virusproteine diffus verteilt im Zellkern. Sind beide Proteine vorhanden, können sie interagieren und es kommt zu einer Verlagerung von pUL31 an die Kernmembran. Die Expression dieser beiden viralen Proteine reicht aus, um Membranvesikel von der inneren Kernmembran abzuschnüren, die primären Virushüllen ähneln (Klupp et al., 2007). Geklärt werden soll nun der molekulare Mechanismus der Vesikelbildung, Abschnürung und Fusion. Wir konnten bereits zeigen, dass die viralen Glykoproteine, die an der Fusion während des Eintritts in Wirtszellen eine Rolle spielen, an diesem Prozess nicht beteiligt sind (Klupp et al., 2008).

Abb. 5: Primäre Virushüllen im Kernspalt.

Literatur

  • Klupp B.G., H. Granzow, W. Fuchs, G.M. Keil, S. Finke, and T.C. Mettenleiter. 2007. Vesicle formation from the nuclear membrane is induced by coexpression of two conserved herpesvirus proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104: 7241-7246.
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17426144
  • Klupp, B.G., J. Altenschmidt, H. Granzow, W. Fuchs, and T.C. Mettenleiter. 2008. Glycoproteins required for entry are not necessary for egress of pseudorabies virus. J. Virol. 82:6299-309.
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18417564

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Funktion und Wechselwirkung viraler und zellulärer Proteine beim Viruszusammenbau

Herpesviruspartikel bestehen aus mindestens 30 verschiedenen Proteinen, die beim Viruszusammenbau in die vier strukturellen Untereinheiten eingebaut werden müssen (Abbildung 1). Während der Zusammenbau des Kapsids und die Verpackung des Genoms im Kern der infizierten Zelle stattfinden, werden der größte Teil des Teguments und die Virushülle im Zytoplasma zusammengefügt. Dieser als secondary envelopment bezeichnete Prozess folgt einem komplizierten Muster von Proteinwechselwirkungen. Die Aufklärung der Interaktionen und Rolle der Tegumentproteine beim Zusammenbau sind Gegenstand von Untersuchungen in unserem Labor.

Abb. 6: Virale und zelluläre Interaktionspartner.

Literatur

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Funktionelle Charakterisierung aller Genprodukte des PrV

Das PrV Genom kodiert für mindestens 70 verschiedene Proteine. Während die Funktion einiger dieser Genprodukte schon gut verstanden ist, gibt es für eine Reihe von Virusproteinen noch keine funktionelle Zuordnung. Ein Gesamtbild der Funktionen der verschiedenen Proteine bei der Virusvermehrung ist Ziel unserer Arbeiten. Eine Beschreibung der identifizierten Gene bzw. Funktion der entsprechenden Genprodukte findet sich im Kapitel "PrV Gene Annotations".

Abb. 7: Anordnung der offenen Leseraster und Transkripte im Genom des PrV.

Literatur

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Grundlagen des Neurotropismus

Als neurotropes Alphaherpesvirus besitzt PrV die Eigenschaft, sich nach Infektion peripherer Epithelien und Nervenendigungen intra- und transneuronal auszubreiten. Die molekularen Grundlagen für diese neuronengebundene Ausbreitung sind weitgehend unbekannt. Durch Markierung des kleinen Kapsidproteins pUL35 mit dem autofluoreszierenden GFP können Kapside in Echtzeit mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie lokalisiert und verfolgt werden. In Kombination mit Elektronenmikroskopie und gezielter Mutagenese untersuchen wir die molekularen Grundlagen der neuronalen Ausbreitung an Neuronenkulturen.

Abb. 8: Vergleich autofluoreszierender, GFP-markierter Kapside und elektronenmikroskopischer Aufnahme eines PrV-infizierten Rattenneurons.

Die Eigenschaft der neuronalen Ausbreitung von PrV wird außerdem zur Kartierung neuronaler Netzwerke verwendet. Wir haben ein attenuiertes, als Lebendvakzine eingesetztes PrV (Stamm Bartha) genetisch so verändert, dass von diesem Virus infizierte Zellen schnell durch einfache Detektionsreaktionen nachgewiesen werden können. Unterschiedlich markierte Virusmutanten erlauben die gleichzeitige Verfolgung mehrerer Nervenschaltkreise. Die Technik des 'viralen Tracing' erfreut sich in der Neuroanatomie und -biologie steigender Beliebtheit, wobei gegenüber anderen verwendeten Tracern, wie z. B. dem Herpes simplex Virus oder dem Tollwutvirus, PrV den entscheidenden Vorteil der fehlenden Humanpathogenität aufweist.

Literatur

  • Rothermel M., N. Schöbel, N. Damann, B.G. Klupp, T.C. Mettenleiter, H. Hatt, and C.H. Wetzel. 2007. Anterograde transsynaptic tracing in the murine somatosensory system using Pseudorabies virus (PrV): a "live-cell"-tracing tool for analysis of identified neurons in vitro. J. Neurovirol. 13: 579-585.
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18097889
  • Rothermel, M., D. Brunert, B.G. Klupp, M. Luebbert, T.C. Mettenleiter, and H. Hatt. 2009. Advanced tracing tools: functional neuronal expression of virally encoded fluorescent calcium indicator proteins. J. Neurovirol. 15:458-464.
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20105103
  • Maresch, C., H. Granzow, A. Negatsch, B.G. Klupp, W. Fuchs, J.P. Teifke and T.C. Mettenleiter. 2010. Ultrastructural analysis of virion formation and anterograde intraaxonal transport of the alphaherpesvirus pseudorabies virus in primary neurons. J. Virol., in press.
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20237081

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