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Nationales Referenzlabor für virale Pferdeenzephalomyelitiden (EEEV, VEEV, WEEV)

Im Nationalen Referenzlabor (NRL) für virale Pferdeenzephalomyelitiden (EEEV, VEEV, WEEV) werden Erkrankungen untersucht, die durch das venezolanische (VEE), östliche (EEE) und westliche (WEE) Pferdeenzephalomyelitisvirus verursacht werden. Die auslösenden Viren gehören taxonomisch dem Genus Alphavirus aus der Familie Togoviridae an und werden den Arboviren zugeordnet, da sie über Stechmücken, sogenannte Vektoren, übertragen werden. Das Hauptreservoir bilden Vögel, bzw. im Falle des VEEV auch kleine Säugetiere, die selbst nicht oder nur leicht erkranken. Die genannten Viren besitzen ein zoonotisches Potential, d.h. sie können durch geeignete Vektoren auch auf den Menschen übertragen werden. Menschen und Pferde sind für EEEV und WEEV sogenannte Fehlwirte, von denen keine erneute Infektion ausgeht. Infektionen der Fehlwirte verlaufen meist asymptomatisch, können aber auch mit massiven zentralnervösen Schädigungen und dem Tod einhergehen. Im Falle von VEEV kommt es ebenfalls meist zu milden Verlaufsformen, allerdings können Pferde und Menschen auch als Infektionsquelle für VEEV fungieren.

Das Nationale Referenzlabor wendet verschiedene molekularbiologische und biochemische Methoden in Kombination an, um diese anzeigepflichtigen Krankheiten sicher identifizieren und differenzieren zu können. Der Nachweis des viralen Genoms ist aus Blutproben nur während einer akuten Virämie möglich. Da neurologische Symptome jedoch erst auftreten, nachdem die Viren zentralnervöse Gewebe infiziert haben, ist zu diesem Zeitpunkt die Virenlast im Blut bereits erheblich zurückgegangen. Daher eignen sich hier neurobiologische Gewebeproben besser als Ausgangsmaterial für Untersuchungen. Das virale Genom wird mittels quantitativer RT-PCR (RT-qPCR) mit Hilfe spezifischer Primer/Sonden-Kombinationen nachgewiesen. Diese Methode erlaubt neben dem qualitativen Nachweis des Genoms der Viren auch eine Aussage über die Virenlast in den eingesandten Proben. Neben dieser quantitativen Bewertung hat auch die höhere Spezifität der Methode sowie ihre geringere Anfälligkeit für Kontaminationen dazu beigetragen, dass sie die klassische (semi-) nested RT-PCR für diese Viren in der Diagnostik abgelöst hat.

Um eine Aussage über den serologischen Status eines eventuell infizierten Organismus machen zu können, wurden ELISA-Systeme etabliert. Mit einer Weiterentwicklung des IgM-ELISAs, der im OIE-Referenz-Labor in Ames/Iowa verwendet wird, lassen sich spezifisch IgM-Antikörper im Blut von Pferden nachweisen. Das Vorhandensein dieses Immunglobulin-Typs weist eine akute Infektion nach, wohingegen positive Ergebnisse von ELISA-Systemen, die IgG-Antikörper nachweisen, auf eine bereits länger zurückliegende Infektion oder aber auch eine erfolgreiche Impfung hinweisen. Aufgrund der Zusammenarbeit mit dem OIE-Referenzlabor konnte eine geringe Anzahl positiver Seren erhalten werden, mit deren Hilfe dieser Test für EEEV und VEEV etabliert werden konnte. Aufgrund der geringen Anzahl erhältlicher Positivproben steht die abschließende Validierung des Systems noch aus. Letzteres gilt ebenfalls für einen etablierten kompetitiven ELISA, der für die genannten Viren auch eine speziesübergreifende Diagnose erlaubt.

Beide ELISA-Testsysteme wurden zur Untersuchung von Pferdeseren aus verschiedenen Teilen Deutschlands eingesetzt. Erwartungsgemäß wurden keine positiven Befunde erhalten, da EEEV, VEEV und WEEV in Deutschland und Europa noch als exotische Krankheitserreger gelten.

In den dargestellten diagnostischen Systemen zum Nachweis von Antikörpern werden inaktivierte Viren eingesetzt. Da es sich um Erreger der Sicherheitsstufe 3 handelt, wird der Einsatz rekombinanter Proteine der Virushülle als Virusersatz in den beschriebenen Methoden untersucht. Neben der Etablierung molekularbiologischer und serologischer Testsysteme beschäftigt sich das Labor für Pferdeenzephalomyelitiden auch mit der Untersuchung von Wechselwirkungen viraler Proteine mit Proteinen der Wirtszellen.

Nach DIN EN ISO/IEC 17025:2018 akkreditierte molekularbiologische (RT-qPCR) Untersuchungen können am NRL zurzeit im Rahmen von Freiprüfungen oder zur differentialdiagnostischen Abklärung durchgeführt werden.

  • Antigen- bzw. Genomnachweis in Untersuchungsmaterial
  • Antikörpernachweis
  • Ansprechpartner für Bundes- und Länder- sowie EU-Behörden zu Fragen der Pferdeenzephalomyelitiden - Diagnostik und Bekämpfung
  • Charakterisierung von Virusisolaten
  • Überprüfung, Standardisierung und Weiterentwicklung von diagnostischen Verfahren
  • Teilnahme an Ringtests (national und international)
  • Beteiligung an nationalen und internationalen Arbeitsgruppen und Forschungsprojekten
  • Virusisolierung und Anzucht in vitro
  • Genomnachweis mittels RT-PCR (quantitativ)
  • Stammcharakterisierung durch Genomsequenzierung
  • Quantitativer Nachweis neutralisierender Antikörper (Serumneutralisationstest, Plaque-Reduktionstest, Surrogat-Testformate)
  • Serologischer Nachweis von Antikörpern mit ELISA-Testen inklusive Differenzierung der Immunglobulinklassen
  • Immunfluoreszenz-basierter Nachweis von Antikörpern (iIFA)
  • Probenpanel zur Testung neuer Diagnoseverfahren (RT-PCR)