Institut für Nutztiergenetik (ING)

Nach der Samengewinnung im Stall wird das Ejakulat im Labor auf Menge und Qualität der Spermien untersucht. Im Anschluss wird das Ejakulat mit einem Samenverdünner gemischt und langsam auf 5°C abgekühlt. Die weitere Verarbeitung findet dann in einer Kühltheke statt. Hier wird der verdünnte Samen mit Gefrierschutzsubstanzen (z.B. Glycerol) gemischt und eine definierte Menge von Spermien in bedruckte Plastikhalme (Pailletten/Straws) mit 0,25 mL oder 0,5 mL Fassungsvermögen abgefüllt. Das eigentliche Tiefgefrieren findet entweder in einem computer-gesteuerten Einfriergerät (controlled rate freezer) oder in im Dampf von flüssigem Stickstoff statt. Anschließend werden die Pailletten in Kryocontainern in flüssigem Stickstoff oder Stickstoffdampf bei ca. -196°C aufbewahrt. 

Die Qualitätskontrolle wird vor dem Einfrieren und nach dem Auftauen durchgeführt. Dabei wird untersucht, wie die Spermien aussehen (Morphologie), wie sie sich bewegen (Motilität) und ob die Zellmembranen intakt sind. Für die Motilitätsanalyse wird eine Software verwendet, die die Bewegungsmuster der einzelnen Spermien erkennt. Die Intaktheit der Zellmembranen wird mit Fluoreszenzfarbstoffen getestet.

Im Gegensatz zu kommerziellen Besamungsstationen verwenden wir bei bedrohten Haustierassen keine Mindeststandards für die Verarbeitung des Samens, da wir häufig nur eine begrenzte Menge an Material zur Verfügung haben. Die Qualität des Spermas nach dem Auftauen bestimmt, wie viele eingefrorene Pailletten für eine künstliche Besamung nötig sind. Falls die Qualität des Samens nach dem Auftauen sehr schlecht ist, wird er nur noch für die Befruchtung im Labor durch in vitro Fertilisation (IVF) bzw. eine intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) eingesetzt. Im Anschluss folgt dann die Übertragung der Embryonen in Leihmütter, sogenannte Empfängertiere.

Aktuell liegt der Schwerpunkt auf der Kryokonservierung von frühen Rinderembryonen im Stadium der Blastozyste. Embryonen werden hierfür entweder durch In vivo-Spülungen nach Superovulation und Besamung oder im Labor (in vitro) nach vorheriger Eizellgewinnung vom weiblichen Tier erzeugt. Vor dem Einfrieren werden die Blastozyste nach den Kriterien der International Embryo Transfer Society (IETS) klassifiziert. Hierbei werden sowohl das Entwicklungsstadium als auch die Qualität des Embryos bewertet.

Nicht nur Blastozysten sondern auch frühere Entwicklungsstadien (wie z.B. Morulas) können krykonserviert werden. Allerdings birgt das Blastozystenstadium den Vorteil, dass vor dem Einfrieren Flüssigkeit aus einem inneren Hohlraum (der Blastozystenhöhle) gewonnen werden kann. Über DNA-Reste in der gewonnen Flüssigkeit lässt sich dann u.a. das Geschlecht des Embryos bestimmen und zusätzlich wird durch die Flüssigkeitsreduktion der Kryokonservierungserfolg des Embryos und damit seine spätere Vitalität nach dem Wiederauftauen begünstig.