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Institut für Virusdiagnostik (IVD)

Labor für NGS und Microarray-Diagnostik

Nukleinsäuren (Desoxyribonukleinsäure [DNS] und Ribonukleinsäure [RNA]) sind die Träger der Erbinformationen und speichern als solche in den Genomen die Baupläne aller Organismen und Viren. Darüber hinaus ist die RNA zur Umsetzung der in den Genomen gespeicherten Information in Eiweißstoffe für den Zellaufbau und -stoffwechsel notwendig. Durch die Analyse der Nukleinsäuren kann man detaillierte Informationen über die Eigenschaften bzw. den physiologischen Zustand eines Organismus oder über die Mischung der Organismen in einer Probe erhalten. Die Zusammensetzung der Nukleinsäuren kann mit verschiedenen Methoden analysiert werden. Zwei der dafür zur Verfügung stehenden Methoden werden im Labor für Next Generation Sequencing und Microarray-Diagnositk genutzt. Dazu ist das Labor für Next Generation Sequencing und Microarray-Diagnostik mit einem Genome Sequencer FLX sowie der zur Probenvorbereitung zusätzlich notwendigen apparativen Ausrüstung ausgestattet. Darüber hinaus ist auch die komplette Infrastruktur zur Durchführung von Microarray-Experimenten vorhanden.

Next Generation Sequencing

Unter Next Generation Sequencing (NGS) versteht man die Sequenziermethoden der 2. Generation (Bonetta, L. 2006, Genome sequencing in the fast lane, Nature Methods, 2:141-7), die, anders als die sogenannte klassische Sequenzierung, nicht nach der von Sanger und Kollegen 1977 beschriebenen Kettenabbruchmethode arbeiten (Sanger, F. et al. 1977, DNS sequencing with chain-terminating inhibitors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463–7). Mithilfe der mit den verschiedenen NGS-Methoden eingeführten Technologien wird die DNS-Sequenzierung schneller und zu einem geringeren Preis pro Base als mit der klassischen Sequenzierung möglich. Außerdem sind die NGS-Methoden aufgrund der daraufhin optimierten Protokolle besser für hohen Probendurchsatz geeignet. Durch die in einem Lauf eines NGS-Gerätes zu erzielende große Menge an Rohdaten können zum Beispiel mehrere komplette virale oder bakterielle Genome über Nacht mit großer Genauigkeit sequenziert werden.

Schwerpunkt der Arbeiten im Labor für Next Generation Sequencing und Microarray-Diagnostik ist die Bearbeitung von DNS-Proben unterschiedlichster Herkunft zur Volllängen-Sequenzierung der Genome von DNS- und RNA-Viren sowie zur Metagenomanalyse (Untersuchung der Zusammensetzung der Organismenpopulation in einer beliebigen Probe durch Sequenzierung der gesamten daraus extrahierbaren DNS und/oder RNA). Neben den Komplettgenom- und Metagenom-Sequenzierungen können auch Amplikonsequenzierungen (Sequenzierung eines kurzen Genom-Abschnittes zur Analyse der dort auftretenden Sequenzvariationen) durchgeführt werden. Über die Sequenzierung hinaus stellt die Etablierung neuer Methoden sowohl auf der apparativen, der molekularbiologisch-methodischen als auch auf der datenanalytischen Ebene einen wichtigen Bestandteil der Arbeiten dar. Hierzu gehört unter anderem die Entwicklung von Methoden zur Probenvorbereitung für die Sequenzierung mittels Genome Sequencer FLX. Dies geschieht in enger Zusammenarbeit mit den Kollegen der spezialisierten Labore des FLI.

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Microarrays

Microarrays wurden 1995 erstmals von Schena und Mitarbeitern vorgestellt (Schena, M. et al. 1995, Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNS Microarray, Science, 270:467-70) und dienten zunächst der Transkriptomanalyse, also der Bestimmung der Aktivität aller Gene einer Zellpopulation zu einem bestimmten Zeitpunkt. Alsbald wurde damit begonnen, Microarrays auch für diagnostische Zwecke zu adaptieren (eine gute Übersicht zur Entwicklung der Microarray-Technologie und deren Einsatz in der Diagnostik findet sich in Heller, M.J. 2002, DNS MICROARRAY TECHNOLOGY: Devices, Systems, and Applications, Annu. Rev. Biomed. Eng.,4:129–53). Inzwischen sind Microarrays unterschiedlicher Größen und Ausführungen in der Diagnostik etabliert. Anders als bei der Metagenomanalyse zur Untersuchung der Zusammensetzung der DNS einer beliebigen Probe kann mittels Microarrays nur das Vorkommen von Nukleinsäuren vorgegebener Basen-Sequenz in einer Probe nachgewiesen werden. Diese Sequenz ist durch die auf dem Array aufgebrachten Sonden vorgegeben. Vorteil der Microarrays ist jedoch der geringere finanzielle und bioinformatische Aufwand zur Untersuchung der Probe.

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Bioinformatik

Über die Durchführung der Microarray-Analysen und Sequenzierung hinaus ist die Auswertung der bei den beiden Techniken anfallenden großen Datensätze wichtigster Bestandteil der im Labor für Next Generation Sequencing und Microarray-Diagnostik durchgeführten Arbeiten. Dies ist insbesondere deshalb sehr wichtig, weil nur durch zuverlässige Methoden der Datenauswertung aus den großen Mengen an bloßen Rohdaten, die mit beiden Methoden generiert werden, zuverlässige aussagekräftige Informationen gewonnen werden können. Besonderes Augenmerk beim Einsatz und der Anpassung bioinformatischer Methoden für die Datenanalyse liegt dabei auf der Möglichkeit, wiederkehrende Arbeiten zu automatisieren sowie Methoden für die Analyse der Daten zu etablieren, die durch den Benutzer an veränderte Bedingungen angepasst werden können und zugleich robust zuverlässige und aussagekräftige Informationen liefern. Außerdem soll zu jeder Zeit die komplette Methodik der Datenauswertung für den Nutzer nachvollziehbar sein, da nur so die Beurteilung der Aussagekraft der gewonnenen Ergebnisse möglich ist.

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